新羿數(shù)字PCR平臺助力mRNA疫苗工藝質(zhì)控
發(fā)布日期：2022-06-17
mRNA由DNA作為模板轉(zhuǎn)錄而來，其攜帶的遺傳訊息指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。mRNA疫苗通過修飾病原微生物中特異性的靶標(biāo)蛋白mRNA序列，再將其包裹進載體中注射入人體，在人體細(xì)胞內(nèi)mRNA翻譯為靶標(biāo)蛋白，最終誘導(dǎo)人體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。隨著新冠病毒的爆發(fā)及全球流行，mRNA疫苗因其研發(fā)時間短、生產(chǎn)速度快及成本低、對抗變異病毒的效率高及可誘導(dǎo)較強的免疫反應(yīng)等優(yōu)點，在疫情控制方面發(fā)揮了排頭兵的作用，同時mRNA疫苗技術(shù)在此次新冠疫情中也得到了較大的提升。mRNA疫苗的優(yōu)勢使其成為未來對抗傳染病的一個有希望的方案，基于mRNA的其他產(chǎn)品也被期望在癌癥的臨床治療中發(fā)揮重要作用。
Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13020206.
在mRNA疫苗技術(shù)快速發(fā)展的同時，關(guān)于指導(dǎo)mRNA質(zhì)量非專有方面的監(jiān)管指南和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也在不斷發(fā)展。mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)中宿主細(xì)胞DNA殘留和mRNA質(zhì)量監(jiān)測至關(guān)重要，需要使用敏感且能夠精準(zhǔn)定量的檢測方法為疫苗安全生產(chǎn)把關(guān)。USP指南草案推薦數(shù)字PCR進行mRNA疫苗定量分析檢測
美國藥典（USP）于2022年2月23日發(fā)布了題為“mRNA疫苗質(zhì)量分析方法”的指南草案，草案中推薦了純化mRNA原料藥的鑒別、含量、物理狀態(tài)（完整性）、純度和安全性的質(zhì)量評估方法，便于考察mRNA原料藥相關(guān)的質(zhì)量屬性。USP中指出可以使用數(shù)字PCR（dPCR）對mRNA進行定量，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線。dPCR平臺的檢測步驟為先將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將反應(yīng)體系分割為多個反應(yīng)單元后進行PCR擴增，PCR反應(yīng)結(jié)束后采集各個反應(yīng)單元的熒光信號進行分析，從而實現(xiàn)對單份樣本中核酸物質(zhì)的定量檢測。定量過程中不需要標(biāo)準(zhǔn)品即可絕對定量，實現(xiàn)單份樣品更高的檢測靈敏度，使定量分析達到一個全新的水平。
表1.mRNA原料的質(zhì)量屬性-USP
新羿生物的4×RT-dPCR mix 試劑盒以mRNA為模板，搭配新羿自主研發(fā)的數(shù)字PCR平臺，同時完成逆轉(zhuǎn)錄和擴增步驟，可以高效、特異、靈敏地定量檢測mRNA靶分子。探針涵蓋多種mRNA靶序列，也可以用于檢測基因表達水平的微小變化。
《藥典》規(guī)定需對宿主細(xì)胞殘留DNA精準(zhǔn)定量mRNA原液生產(chǎn)工藝一般分為兩個階段，即DNA轉(zhuǎn)錄模板的制備和mRNA的制備。DNA轉(zhuǎn)錄模板是通過構(gòu)建靶標(biāo)基因DNA序列的克隆質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌中進行擴繁，再抽提獲得大量的攜帶靶標(biāo)DNA序列的質(zhì)粒進行酶切獲得。在質(zhì)粒DNA抽提過程中殘留的宿主細(xì)胞DNA會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄mRNA的質(zhì)量。其他生物制品中宿主細(xì)胞DNA殘留也會存在一定的風(fēng)險，如病毒性疫苗中宿主細(xì)胞殘留DNA相關(guān)的風(fēng)險主要是感染性和致癌性，如果存在逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒，其基因會整合入受者基因組可能導(dǎo)致感染；如果存在病毒或傳代細(xì)胞基質(zhì)中的致癌基因，則可能具有引發(fā)腫瘤的潛在風(fēng)險。綜上所述必須對殘留的DNA進行監(jiān)測，以確保DNA模板的純度和安全性。
建立合適的宿主殘留DNA的檢測方法對監(jiān)測生物制品的安全性和質(zhì)量可控性至關(guān)重要。近幾年，國內(nèi)外各類監(jiān)管機構(gòu)出臺了生物制品中可接受的宿主細(xì)胞殘留DNA水平的指導(dǎo)方針。我國《藥典》第三部對生物制品的相關(guān)規(guī)定也指出，應(yīng)對半成品中殘留外源性DNA含量進行檢測，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。各國藥典也陸續(xù)提供了數(shù)種檢測宿主細(xì)胞殘留DNA的經(jīng)典方法，包括閾值法、雜交法及實時定量PCR，但是傳統(tǒng)的檢測方法存在有弊端。目前，基于實時熒光定量PCR(qPCR)的方法被廣泛應(yīng)用于宿主細(xì)胞殘留DNA的定量，但是qPCR的檢測結(jié)果與真實的殘留DNA含量有很大差異性，檢測重復(fù)性不好，并且qPCR定量依賴于標(biāo)準(zhǔn)品，只能進行相對定量，已漸漸不能滿足產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量控制的要求。區(qū)別于qPCR對擴增循環(huán)數(shù)進行相對定量的方法，dPCR技術(shù)是根據(jù)泊松分布原理及陰性、陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度，dPCR可以實現(xiàn)絕對定量，具有更高的靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。
新羿的Probe dPCR SuperMix結(jié)合數(shù)字PCR平臺對宿主細(xì)胞DNA殘留進行精準(zhǔn)定量，實驗操作簡便、數(shù)據(jù)分析容易、結(jié)果明了，具有廣泛應(yīng)用前景的方法。Probe dPCR Multiplex Supermix在通用試劑基礎(chǔ)上進行優(yōu)化升級，可大幅度提升多重數(shù)字PCR的性能，4x濃縮液可加入更大樣本量，提高靈敏度，增加微滴群區(qū)分度，減少體系優(yōu)化步驟。Probe dPCR Faster Supermix搭載快速PCR程序進行高效的數(shù)字PCR檢測，可縮短變性及退火延伸時間、提高變溫速率，30-60分鐘內(nèi)完成微液滴式的擴增反應(yīng)，提升單位時間內(nèi)的樣本檢測通量。
● 無需標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量 ( DNA / mRNA / miRNA / LncRNA ）● 提高對抑制物的耐受程度 (克服抑制物對定量結(jié)果的干擾）● 更高的檢測靈敏度 (提升高豐度野生型背景下的<0.1%突變檢出率）● 更高的數(shù)據(jù)精確性 (能識別1.1倍以內(nèi)的濃度變化）● 更好的數(shù)據(jù)重復(fù)性 (對靶標(biāo)核酸含量的連續(xù)監(jiān)測、橫向比較）
新羿微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在PCR擴增前把常規(guī)的PCR的反應(yīng)體系微滴化，形成數(shù)萬個納升級的油包水微滴，這種微滴化的處理，使得每個微滴中的背景DNA或抑制劑能有效的降低，從而提高了擴增的特異性及檢測的靈敏度。新羿生物作為國內(nèi)數(shù)字PCR領(lǐng)域的領(lǐng)先者，擁有數(shù)字PCR平臺從儀器到耗材、試劑的研發(fā)和生產(chǎn)能力。
