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導(dǎo)讀

2019年1月8日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系郭永實(shí)驗(yàn)室合作在《分析學(xué)家》（Analyst）在線發(fā)表題為《基于多重微液滴數(shù)字PCR的胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法》（A Multiplex Droplet Digital PCR Assay for Non-invasive Prenatal Testing of Fetal Aneuploidy）的研究論文，該研究利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)孕婦外周血中的游離DNA，建立了一種胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的新方法。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)第一時(shí)間聯(lián)系了本文第一作者陳芊如進(jìn)行了訪談。

研究背景及內(nèi)容

胎兒染色體非整倍體異常是嚴(yán)重的出生缺陷，最常見的包括21-三體綜合征（即唐氏綜合征，其未干預(yù)的綜合發(fā)病率高達(dá)1/750，且隨著孕婦年齡增加風(fēng)險(xiǎn)急劇增大）、18-三體綜合征和13-三體綜合征等。這類疾病將導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)智力低下、生長發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形乃至死亡，且尚無有效治療手段，而產(chǎn)前篩查和診斷可最有效的避免此類患兒的出生。自孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)游離胎兒DNA以來，研究人員對(duì)其展開大量研究，發(fā)展出基于二代測(cè)序技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)（NIPT），此技術(shù)比傳統(tǒng)唐氏綜合征血清學(xué)篩查更準(zhǔn)確，比羊水穿刺更安全。因?yàn)槠錈o創(chuàng)、安全、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，受到醫(yī)生和孕婦的認(rèn)可并被臨床快速接受，是目前二代測(cè)序技術(shù)最為成功的臨床應(yīng)用。然而，基于二代測(cè)序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)尚存在檢測(cè)周期長，需要1-2周出檢測(cè)報(bào)告、技術(shù)門檻高、檢測(cè)費(fèi)用貴等不足，阻礙了其替代傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查方法成為全面普查項(xiàng)目。

為了解決上述不足，在這項(xiàng)研究中，研究人員使用具有單分子檢測(cè)靈敏度和絕對(duì)定量能力的數(shù)字PCR技術(shù)，開發(fā)了一種簡單有效的染色體非整倍體的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)新方法。該研究使用孕婦外周血，能夠?qū)σ粋€(gè)樣本在約4.5小時(shí)完成無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（圖1）。研究人員首先通過理論計(jì)算，研究能夠精準(zhǔn)分辨21-三體綜合征的影響因素和邊界條件；接著設(shè)計(jì)40對(duì)引物和2個(gè)鎖核酸（LNA）通用探針擴(kuò)增21號(hào)和18號(hào)染色體上的各20個(gè)片段，驗(yàn)證了理論預(yù)測(cè)的可靠性，評(píng)估了檢測(cè)方法的性能指標(biāo)；最后通過60例臨床樣本對(duì)方法的準(zhǔn)確性和臨床適用性進(jìn)行了初步評(píng)估，結(jié)果顯示所有臨床樣本檢測(cè)結(jié)果與基于二代測(cè)序技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果一致率為100%。

基于數(shù)字PCR的染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法流程圖

訪談內(nèi)容

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)第一時(shí)間聯(lián)系了本文的第一作者陳芊如，并進(jìn)行了訪談，請(qǐng)她對(duì)行業(yè)關(guān)心的問題進(jìn)行了解答，以下為訪談內(nèi)容。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)問：您是如何想到將數(shù)字 PCR 技術(shù)應(yīng)用到無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)中的？

答：無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)染色體非整倍體（例如21-三體綜合征）的關(guān)鍵在于定量待測(cè)染色體（例如21號(hào)染色體）和參考染色體（例如除了21號(hào)染色體以外的常染色體），然后計(jì)算待測(cè)染色體和參考染色體數(shù)量的比例，以確定樣本是否為染色體非整倍體。理論上，若胎兒正常則比例為1，若胎兒有染色體三體則比例大于1。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分（在不同孕周有波動(dòng)，比如4%-20%），因此定量的方法需要具有足夠的精準(zhǔn)度才能實(shí)現(xiàn)可靠的檢測(cè)。數(shù)字PCR技術(shù)具有單分子靈敏度和絕對(duì)定量的能力，能夠區(qū)分微小差異，很適合用來進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)問：對(duì)比于現(xiàn)有的二代測(cè)序技術(shù)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，您的發(fā)現(xiàn)最大的突破點(diǎn)在哪里？它將為患者們帶來如何積極的影響？

答：首先，基于數(shù)字PCR技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)能夠在一天內(nèi)給出檢測(cè)結(jié)果，而二代測(cè)序技術(shù)一般需要1-2周；第二，數(shù)字PCR技術(shù)的操作流程和所需儀器相較于二代測(cè)序簡單了許多，因此較容易在一般醫(yī)院的臨床實(shí)驗(yàn)室開展；第三，基于數(shù)字PCR技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)有望實(shí)現(xiàn)更低的檢測(cè)成本，因?yàn)槠鋬x器、試劑的成本都較二代測(cè)序的低，當(dāng)檢測(cè)價(jià)格足夠低，就有機(jī)會(huì)覆蓋更大的人群。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)問：這一技術(shù)是否還有其他的應(yīng)用方向？

答：數(shù)字PCR技術(shù)在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，比如基因表達(dá)差異、拷貝數(shù)變異、核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定標(biāo)、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、基因編輯驗(yàn)證、二代測(cè)序建庫和驗(yàn)證、器官移植排斥監(jiān)測(cè)、感染性疾病早期檢測(cè)等。由于其靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)，特別適合于腫瘤液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前篩查這些對(duì)于靈敏度和準(zhǔn)確性要求高的領(lǐng)域。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)問：這一技術(shù)離推廣到臨床應(yīng)用還有多長的路要走？

答：目前的報(bào)道，我們?cè)谠砩贤瓿闪顺醪津?yàn)證，建立了一種較為穩(wěn)健的檢測(cè)方法。后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化，包括進(jìn)一步提高可靠性與準(zhǔn)確性、進(jìn)行更多臨床樣本的驗(yàn)證、實(shí)現(xiàn)更多染色體非整倍體（21、18、13、X、Y）的檢測(cè)。

研究展望

該研究為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域提供了一種新的實(shí)用性思路，對(duì)于如何用數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的診斷試劑開發(fā)給出了可行的設(shè)計(jì)原則。

下一步，研究者們將對(duì)此方法進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，包括進(jìn)一步提高可靠性與準(zhǔn)確性、進(jìn)行更多臨床樣本的驗(yàn)證、實(shí)現(xiàn)更多染色體非整倍體（21、18、13、X、Y）的檢測(cè)。

在醫(yī)療控費(fèi)的背景下，開發(fā)快速簡便的方法對(duì)于在大規(guī)模人群開展無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)具有重要意義。隨著國內(nèi)數(shù)字PCR平臺(tái)的自主研發(fā)與技術(shù)創(chuàng)新，基于數(shù)字PCR的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡便的產(chǎn)前篩查。

后記

陳芊如和陳西華為該論文的共同第一作者，祝令香研究員和郭永研究員對(duì)該研究進(jìn)行了指導(dǎo)，這項(xiàng)研究得到了國家衛(wèi)健委科學(xué)技術(shù)研究所和北京新羿生物科技有限公司的大力支持。本課題得到國家自然科學(xué)基金、中央公益性科研機(jī)構(gòu)基金、企業(yè)橫向合作課題等的經(jīng)費(fèi)資助。

郭永博士和祝令香博士一直致力于微液滴數(shù)字PCR技術(shù)的開發(fā)和轉(zhuǎn)化研究。下一步，會(huì)推動(dòng)多指標(biāo)、自動(dòng)化、低成本數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展，與合作單位一起開展數(shù)字PCR在在重大疾病體外診斷的應(yīng)用研究。

來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)