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2019年8月1日，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系郭永實驗室合作在《Talanta》在線發(fā)表題為《一種用于高精準(zhǔn)和防污染檢測的“準(zhǔn)共聚焦”熒光流式微液滴閱讀儀》（A 'Quasi' Confocal Droplet Reader Based On Laser-Induced Fluorescence (LIF) Cytometry for Highly-Sensitive and Contamination-Free Detection）的研究論文，該研究創(chuàng)新地采用了“準(zhǔn)共聚焦”式檢測光路和全封閉的微流控芯片，實現(xiàn)了微液滴數(shù)字PCR的高精準(zhǔn)和防污染檢測。

微液滴數(shù)字PCR是一種單分子水平的核酸定量分析技術(shù)。其策略是：首先將PCR反應(yīng)體系分割為大量的微液滴，使得絕大多數(shù)微液滴內(nèi)僅含有0個或1個模板分子（分別稱為“陰性微液滴”和“陽性微液滴”）；然后經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，“陽性微液滴”呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號，而“陰性微液滴”呈現(xiàn)出較弱的背景熒光信號；最后，通過微液滴內(nèi)熒光的檢測和分類，可以得到待測模板的拷貝數(shù)。

數(shù)字PCR的微液滴直徑介于10-100 μm之間，這對傳統(tǒng)熒光檢測技術(shù)提出很高的要求。如果“陽性微液滴”與“陰性微液滴”之間的熒光信號對比度偏低，將引發(fā)“陽性微液滴”與“陰性微液滴”區(qū)分的困難和錯誤。與此同時，由于微液滴數(shù)字PCR具有超高的靈敏性，在PCR反應(yīng)后的任何開放式操作都可能造成微液滴內(nèi)容物的揮發(fā)和逸出，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染。目前商業(yè)化微液滴數(shù)字PCR儀器多涉及PCR反應(yīng)后的開放式操作，比如微液滴的吸取和轉(zhuǎn)移等，這在臨床應(yīng)用中可能導(dǎo)致樣本假陽性的嚴(yán)重后果。

為了解決上述不足，在這項研究中，研究人員采用了“準(zhǔn)共聚焦”式熒光流式來構(gòu)建微液滴閱讀儀的光路（圖1），其激發(fā)光路采用了新型的離焦激發(fā)模式，使得激發(fā)光斑恰好與微液滴的尺寸相匹配，最大限度地激發(fā)整個微液滴內(nèi)的熒光信號，提高“陽性微液滴”與“陰性微液滴”之間的信號對比度；其熒光檢測光路使用與微流道共軛的小孔來消除微流道以外的雜散光，提高熒光信號的信噪比。基于上述光路，研究人員實現(xiàn)了10-10,000模板拷貝的微液滴數(shù)字PCR高靈敏度檢測，其相對誤差小于5%，線性度r2＞0.998。

圖1：微液滴閱讀儀采用的“準(zhǔn)共聚焦”熒光流式光路

與此同時，研究人員設(shè)計了新型的微流控芯片（圖2），該芯片采用了一種“密封-穿刺”的結(jié)構(gòu)，使用適配器（Adaptor）在管蓋（Rubber cap）外側(cè)形成更大范圍的密封，使得反應(yīng)管蓋被刺穿時微液滴處于一個更大的密閉空間中，從而在檢測過程中保持了嚴(yán)格的密閉，避免微液滴核酸擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠的污染?；谏鲜鲂酒Y(jié)構(gòu)，研究人員在連續(xù)進(jìn)行了7天表皮生長因子受體基因（EGFR）T790M突變位點(diǎn)的檢測后，將6管未加任何模板的EGFR T790M反應(yīng)體系暴露于微液滴閱讀儀周邊15分鐘，以充分地吸收可能從微液滴閱讀儀中逸出的氣溶膠污染。微液滴數(shù)字PCR的檢測結(jié)果顯示，所有6管未加模板的EGFR T790M反應(yīng)體系全部呈陰性結(jié)果，證明該微液滴閱讀儀可有效避免微液滴數(shù)字PCR的污染。

圖2：微液滴閱讀儀采用的微流控芯片

該研究為微液滴數(shù)字PCR的臨床應(yīng)用提供了一種高靈敏和防污染的自動化檢測裝置。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，開發(fā)高靈敏和防污染的單分子核酸檢驗和定量分析技術(shù)對于疾病的篩查、診斷、用藥指導(dǎo)、病情監(jiān)測和預(yù)后均具有重要意義。

清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院的朱修銳博士和劉寶霞博士為該論文的共同第一作者，醫(yī)學(xué)院郭永研究員和精儀系荊高山博士對該研究進(jìn)行了指導(dǎo)，北京新羿生物科技有限公司參與了合作研究。本課題得到國家自然科學(xué)基金和北京新羿生物科技有限公司橫向合作課題等的經(jīng)費(fèi)資助。

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