發(fā)布日期：2020-12-22
摘要
北京大學人民醫(yī)院胸外科楊帆團隊和清華大學醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系郭永團隊合作，在《OncoTargets and Therapy》發(fā)表題為"Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of de novo EGFR T790M Mutation in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer"的研究論文，該研究使用新羿TD-1數(shù)字PCR平臺，驗證了非小細胞肺癌病人中原發(fā)EGFR T790M突變與共存的致敏EGFR突變在等位基因上的順反式關(guān)系（順式排列指兩個位點在同一條DNA分子上，反式排列則是指兩個位點不在同一條DNA分子上，這兩種不同排列方式導致患者對藥物的敏感性不一樣），并探索了福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本對檢測原發(fā)EGFR T790M突變的影響。
方法與結(jié)果
該研究入組了300例中國非小細胞肺癌患者，所有病人都未使用過EGFR-TKIs。對于前250例患者（A組），通過外科手術(shù)獲取腫瘤組織后快速冷凍后保存于-80℃；對于后50例患者（B組），獲取病人的腫瘤組織和癌旁正常組織，并分別制作成冰凍腫瘤組織、FFPE腫瘤組織、冰凍正常組織和FFPE正常組織。對A組的250例冰凍腫瘤組織進行EGFR基因突變檢測，并對同時檢出T790M突變和致敏EGFR突變的樣本進行等位基因順反式檢測。對B組的4種類型樣本進行EGFR基因突變檢測，分析4種類型樣本中T790M突變比例。（詳細流程見圖1）
300例冰凍組織EGFR檢測結(jié)果如下表：
對3例為L858R+T790M雙陽性樣本。進一步構(gòu)建了L858R+T790M雙重檢測體系，用總RNA分析L858R和T790M的順反式關(guān)系，結(jié)果表明，這3例樣本均為順式關(guān)系，即L858R和T790M突變存在于同一條DNA分子上（圖2）。
圖2（A）顯示了野生型EGFR的NSCLC細胞系的FAM非特異性信號。（B、C、D）3例NSCLC患者，同時伴有原發(fā)T790M和L858R突變，用ddPCR方法檢測兩種突變的等位基因關(guān)系，B、C、D所示為EGFR的原發(fā)T790M（FAM標記）和L858R（VIC標記）的雙陽性信號， FAM和VIC陰性信號以黑色表示。野生型EGFR L858R和野生型T790M突變的信號以藍色表示。EGFR L858R突變陽性的信號以綠色表示。原發(fā)T790M伴隨順式L858R突變的雙陽性信號以橙表示。
對B組的50例病人的4種類型樣本進行19Del、L858R和T790M檢測，發(fā)現(xiàn)T790M在癌旁正常組織FFPE樣本的豐度為0.1%-0.5%，而同樣的冰凍組織的突變豐度均低于0.1%。這提示在用FFPE樣本檢測T790M突變時，需仔細確認判讀的cut off。
研究結(jié)論
2.本研究發(fā)現(xiàn)的3例L858R+T790M雙陽性樣本為順式突變，數(shù)字PCR可以有效檢出。
3.福爾馬林固定造成的人工突變會影響FFPE樣本的T790M突變檢測。所以使用ddPCR檢測FFPE樣本前，應仔細驗證ddPCR檢測體系的分析cut off值。
作者介紹
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