臨床應(yīng)用丨數(shù)字PCR在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

發(fā)布日期：2022-07-19

產(chǎn)前診斷是運用各種技術(shù)手段，在出生前對胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進(jìn)行檢測診斷，對可治性疾病可選擇適當(dāng)時機(jī)行宮內(nèi)治療；不可治療的疾病做到知情選擇。而產(chǎn)前診斷中胎兒組織取材，通過介入性產(chǎn)前診斷時不可避免混入母體成分,容易影響胎兒遺傳物質(zhì)診斷的準(zhǔn)確性；無創(chuàng)產(chǎn)前診斷雖可避免流產(chǎn)風(fēng)險，但孕早期胎兒游離DNA（cfDNA）含量低，大量母體DNA的存在，對核酸提取技術(shù)及檢驗技術(shù)提出更高要求。相較于普通熒光定量PCR及其他分子診斷技術(shù)，數(shù)字PCR 以其超高靈敏度、不受背景信號干擾、絕對定量等特點在產(chǎn)前診斷技術(shù)中占有一定優(yōu)勢。

數(shù)字PCR在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

┃數(shù)字PCR用于胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前檢測

新羿團(tuán)隊開發(fā)了一種實用的基于數(shù)字PCR的 NIPT 方法，選擇 chr21 上的 20 個基因座和 chr18 上的 20 個基因座并設(shè)計了相應(yīng)的引物對和探針，通過chr21 總拷貝數(shù)與chr18 總拷貝數(shù)的比值測定胎兒是否為非整倍體^[1]。為了驗證基于多重數(shù)字PCR的 NIPT 的準(zhǔn)確性和臨床適用性，測試來自 30 名孕婦的血漿 DNA 樣本，其中包括 16 名男性胎兒和 14 名女性胎兒。使用 NGS 對所有樣本進(jìn)行三體風(fēng)險狀態(tài)分類，數(shù)字PCR檢測結(jié)果與NGS檢測結(jié)果完全一致。

圖 使用數(shù)字PCR檢測30例臨床樣本結(jié)果

┃基于重復(fù)片段用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新方法

廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、分子診斷教育部工程研究中心李慶閣教授團(tuán)隊與廈門大學(xué)健康醫(yī)療大數(shù)據(jù)國家研究院、蘇州市立醫(yī)院合作，基于新羿生物的微滴式數(shù)字PCR，提出了創(chuàng)新NIPT方案^[2]。文章圍繞人類染色體非整倍體檢測的生物標(biāo)記物——重復(fù)片段(segmental duplication，SD)開發(fā)了計算程序ChAPDes篩選靶點，使用多色探針熔解曲線技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行染色體非整倍體檢測及臨床隊列研究，其中，新羿生物數(shù)字PCR技術(shù)平臺在評估SD片段和驗證無創(chuàng)產(chǎn)前檢測方法學(xué)中起到關(guān)鍵作用。

圖A 數(shù)字PCR方法檢測染色體非整倍體

圖B 數(shù)字PCR方法用于NIPT的理論模型分析與臨床評價

收集孕周為 14-20 周的 NIPT 樣本進(jìn)行臨床評價，使用基于數(shù)字PCR方法進(jìn)行21三體綜合征的無創(chuàng)檢測和雙盲分析，檢測結(jié)果與 NGS 完全一致。本研究證實SD片段可作為人類染色體非整倍體檢測的首選生物標(biāo)記物，為大規(guī)模產(chǎn)前診斷提供了新的途徑。結(jié)合數(shù)字PCR技術(shù)，類似的檢測策略也可用于診斷其他染色體數(shù)目異常和遺傳疾病。

數(shù)字PCR在單基因遺傳病診斷中的應(yīng)用

脊髓性肌萎縮癥(Spinalmuscularatrophy，SMA)是兒童最常見的遺傳性神經(jīng)肌肉病，目前用于SMA相關(guān)基因檢測和拷貝數(shù)確定的方法復(fù)雜、耗時或無法同時檢測多個靶標(biāo)。新羿生物基于其自主知識產(chǎn)權(quán)的5色熒光流式數(shù)字PCR技術(shù)，與清華大學(xué)等單位合作，建立了能夠在單管檢測，同時提供 SMN1 與 SMN2 拷貝數(shù)的方法，具有準(zhǔn)確、快速、操作簡單、樣本用量少和適用于多種類型樣本的優(yōu)勢^[3]。與現(xiàn)有的檢測方法如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和熒光定量PCR（qPCR）相比，本方法能精準(zhǔn)檢測更多靶標(biāo)，且本方法對模板量要求低（≥ 1.5 ng）；與金標(biāo)準(zhǔn)方法多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）相比，本方法檢測周期更短（首次出結(jié)果由24 h縮短為2.5 h）、操作更簡單、對模板量的要求低和適用于更多種類型樣本（羊水、絨毛膜、外周血、口腔拭子、干血斑）。為SMA的分子診斷、大規(guī)模篩查和疾病嚴(yán)重程度評估提供了一個有力的工具。

┃參考文獻(xiàn)

[1] Tan, C. et al. (2019). A multiplex droplet digital PCR assay for non-invasive prenatal testing of fetal aneuploidies. Analyst, 144(7):2239-2247.

[2] Chen, X. et al. (2021). Segmental duplication as potential biomarkers for non-invasive prenatal testing of aneuploidies. Ebiomedicine, 70, 103535.

[3] Tan, C. et al. (2022). Single-tube multiplex digital polymerase chain reaction assay for molecular diagnosis and prediction of severity of spinal muscular atrophy. Analytical Chemistry, 94(8), 3517-3525.

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