HIV療失敗的核心挑戰(zhàn)在于耐藥突變（DRMs）的早期監(jiān)測。傳統(tǒng)Sanger測序?qū)Φ皖l突變（<20%）檢測靈敏度不足，而二代測序（NGS）雖可檢測低頻變異(1-5%)，但由于普通PCR（bulk PCR）擴(kuò)增步驟，在擴(kuò)增過程中可能引入偏好性偏差導(dǎo)致低頻突變比例被低估。北京地壇醫(yī)院團(tuán)隊(duì)通過創(chuàng)新性應(yīng)用數(shù)字PCR擴(kuò)增（新羿數(shù)字PCR平臺(tái)）聯(lián)合NGS測序，將低頻耐藥突變的檢測靈敏度提升至1%以下，且通過單分子擴(kuò)增有效降低了普通PCR的擴(kuò)增偏好性，為臨床提供了更精準(zhǔn)的耐藥監(jiān)測方案。

研究方法

2023-2024年北京地壇醫(yī)院106例ART治療失敗的HIV感染者（病毒載量≥50 copies/mL），按病毒載量分層（<1000、1000-9999、>10000 copies/mL）。

※ 技術(shù)對(duì)比

- 新羿dPCR vs 普通PCR：同步擴(kuò)增HIV-1 pol基因（PR/RT/IN區(qū)），比較擴(kuò)增效率；后續(xù)進(jìn)行Sanger測序和NGS測序，分析低頻突變檢出差異。

- 關(guān)鍵改進(jìn)：dPCR通過微滴分割（單分子擴(kuò)增）減少擴(kuò)增偏差，提升低頻突變富集能力。

關(guān)鍵結(jié)果

※ 技術(shù)性能

- 擴(kuò)增成功率：dPCR整體達(dá)97.2%（PR/RT區(qū)）和93.4%（IN區(qū)），與普通PCR無顯著差異（P>0.05）。

- 一致性驗(yàn)證：99%（102/103）樣本的兩種方法擴(kuò)增序列聚類一致，證實(shí)dPCR結(jié)果可靠性。

※ 耐藥突變檢出

- Sanger測序：50.5%（52/103）樣本檢出耐藥突變，NNRTIs耐藥率最高（37.9%，如K103N、V106M）。

- NGS低頻突變：普通PCR擴(kuò)增聯(lián)合NGS僅檢出31個(gè)突變，dPCR擴(kuò)增聯(lián)合NGS檢出39個(gè)突變（+25.8%），包括與當(dāng)前治療相關(guān)的Y181C、M184V等關(guān)鍵位點(diǎn)。

臨床意義

治療失敗預(yù)警：低頻突變≥1%時(shí)，NNRTIs方案失敗風(fēng)險(xiǎn)增加（5例繼續(xù)使用TDF+3TC+EFV均失敗）；≥2%突變可能發(fā)展為優(yōu)勢毒株如患者1684的M184V突變在病毒反彈時(shí)被確認(rèn)）。。

方案優(yōu)化：檢出低頻NRTIs突變（如K65R）后，換用INSTIs/PIs方案（如DTG+3TC）可提高治療成功率（9/15例病毒抑制）。

臨床啟示

※ 檢測策略

對(duì)治療失敗患者，推薦dPCR擴(kuò)增聯(lián)合NGS，以捕獲低頻耐藥突變。

※ 臨床應(yīng)用價(jià)值

- 優(yōu)化治療方案：dPCR擴(kuò)增與NGS聯(lián)合檢測可發(fā)現(xiàn)sanger測序遺漏的低頻耐藥突變，指導(dǎo)臨床優(yōu)先選擇耐藥屏障更多的藥物（如INSTIs）或增效PI方案，提升治療成功率。

- 精準(zhǔn)耐藥監(jiān)測：對(duì)治療失敗患者（尤其是病毒載量較低或懷疑存在低頻突變的病例）常規(guī)進(jìn)行dPCR擴(kuò)增與NGS聯(lián)合檢測，進(jìn)行精準(zhǔn)的耐藥監(jiān)測。

總結(jié)與討論

※ dPCR獨(dú)立檢測HIV-1耐藥的優(yōu)勢

- 超高靈敏度，精準(zhǔn)捕獲低頻突變：通過微滴單分子擴(kuò)增技術(shù)，消除引物競爭偏倚，可檢測<1%的低頻耐藥突變。

- 低病毒載量樣本仍保持優(yōu)異性能：基于微滴分區(qū)擴(kuò)增技術(shù)，有效降低優(yōu)勢模板競爭，確保稀有耐藥突變信號(hào)不被淹沒。對(duì)低病毒載量樣本仍保持優(yōu)異性能。

- 絕對(duì)定量，結(jié)果更可靠：無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接輸出耐藥突變絕對(duì)比例，助力臨床決策。

※ dPCR獨(dú)立檢測的可行性

- 多重檢測能力：單管反應(yīng)可同步檢測HIV-1核心耐藥位點(diǎn)（如K65R、M184V、K103N等），實(shí)現(xiàn)高效全面的耐藥分析。

- 無需NGS輔助：超高靈敏度結(jié)合特異性探針，直接對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)定量，省去復(fù)雜測序流程。

- 快速經(jīng)濟(jì)：3小時(shí)內(nèi)完成檢測，成本遠(yuǎn)低于NGS，更適合臨床常規(guī)開展。

 未來已來：dPCR引領(lǐng)HIV-1耐藥檢測新標(biāo)準(zhǔn)

數(shù)字PCR不僅是擴(kuò)增技術(shù)的突破，更具備全流程解決方案的潛力。隨著耐藥Panel的優(yōu)化，dPCR有望成為HIV-1耐藥篩查的首選方案，讓精準(zhǔn)醫(yī)療更高效、更可及！

如果您希望了解dPCR在HIV-1耐藥檢測中的完整應(yīng)用方案，或獲取定制化服務(wù)，請(qǐng)聯(lián)系我們！

●關(guān)于新羿生物●