摘要

2020年7月6日，北京大學(xué)國際醫(yī)院，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京天壇醫(yī)院以及清華大學(xué)的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)在國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)協(xié)會的官方雜志《Clinica Chimica Acta》發(fā)表了題為“Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients”的研究論文。該研究采用新羿TD-1數(shù)字PCR平臺，比較了微滴數(shù)字PCR與傳統(tǒng)的ARMS方法在檢測非小細(xì)胞肺癌患者血漿EGFR突變中的應(yīng)用，并且分析了血漿EGFR突變豐度的動態(tài)變化與酪氨酸激酶抑制劑（TKI）療效的相關(guān)性，為數(shù)字PCR在臨床階段的合理應(yīng)用提供了進(jìn)一步的建議。

研究背景

肺癌是死亡率最高的惡性腫瘤，其中約80%是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。表皮生長因子受體（EGFR）是NSCLC最為常見的驅(qū)動基因，其中18-21號外顯子上的突變對于酪氨酸激酶抑制劑的使用有重要的指導(dǎo)價值，是NSCLC患者的常規(guī)檢測項(xiàng)目。雖然組織標(biāo)本是EGFR突變檢測的首選，但是多數(shù)患者很難提供足量的組織標(biāo)本用于初診和后續(xù)的動態(tài)檢測。在這種情況之下，血漿標(biāo)本之中的游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）成為了一種可選擇的樣本來源。但是外周血之中腫瘤來源DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的含量非常少，這為檢測方法的敏感性提出了極高的要求。數(shù)字PCR具有超高敏感性以及能夠進(jìn)行絕對定量的特點(diǎn)，在EGFR的血漿檢測中具有良好的應(yīng)用前景，但是目前還缺乏經(jīng)過健康監(jiān)管部門批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，而且在臨床之中的合理應(yīng)用也有待進(jìn)一步的探索。

方法與結(jié)果

該研究首先采用參考品對新建立的數(shù)字PCR方法的性能進(jìn)行了評價，獲得了4個不同野生型DNA載量（200，1,000，3,000和15,000拷貝）下的空白檢測限（limit of blank，LoB），并用突變DNA梯度稀釋測試，結(jié)果證實(shí)數(shù)字PCR的敏感性可以達(dá)到0.1%的突變率。

之后，將數(shù)字PCR方法應(yīng)用于NSCLC患者的血漿cfDNA樣品的檢測，共計(jì)入組了77例患者，其中50例為EGFR狀態(tài)未知的測試組，通過與Super-ARMS檢測結(jié)果的比較來確定判讀的閾值；另外27例為常規(guī)檢測已知EGFR突變的驗(yàn)證組，用于驗(yàn)證閾值的可靠性。研究發(fā)現(xiàn)患者的cfDNA總拷貝數(shù)整體偏低（超過70%的患者低于1000個拷貝）且高度可變（范圍為1.6-38725拷貝之間），提示在制定判讀閾值的時候需要考慮總拷貝數(shù)的因素。

結(jié)合上述結(jié)果以及測試組患者的Super-ARMS檢測結(jié)果，研究者制定了用于患者檢測的判讀閾值：當(dāng)cfDNA總拷貝數(shù)≥1000時，突變率≥0.1%；當(dāng)cfDNA總拷貝數(shù)<1000時，至少檢測到1個突變拷貝。此外，由于過低的輸入DNA將會造成采樣偏差，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，因此研究者建議設(shè)立一個總拷貝數(shù)的置信區(qū)間（≥200），低于該區(qū)間的樣品，建議進(jìn)行重新采樣或者進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增之后再進(jìn)行數(shù)字PCR檢測。

采用上述判讀標(biāo)準(zhǔn)，在驗(yàn)證組，測試組以及所有患者中均證實(shí)數(shù)字PCR方法具有更高的檢出率和敏感性。

所有患者

對于測試組中數(shù)字PCR檢測結(jié)果為陽性的患者，對其隨訪點(diǎn)上的樣品進(jìn)行了動態(tài)的檢測，并將該結(jié)果與患者臨床治療的相關(guān)性進(jìn)行了分析。證實(shí)在TKI治療期間EGFR突變豐度的增加與降低分別與耐藥和有效相關(guān)，而在化療期間突變豐度的反彈，可能提示了再次使用TKI藥物的理想時機(jī)。

意義與前景

1）本研究采用的新羿TD-1數(shù)字PCR平臺，是具有我國獨(dú)立知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品，自動化的儀器操作保證了微滴生成和檢測過程中的穩(wěn)定性和可比性，獨(dú)立管路和封閉操作的芯片則盡可能避免了氣溶膠污染的可能性?；谏鲜鰞?yōu)勢，該平臺有望在未來通過審批并應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測。

2）數(shù)字PCR在超高敏感性和絕對定量方面具有明顯的優(yōu)勢，非常適合血液標(biāo)本的定性突變分析和定量動態(tài)監(jiān)測，對于TKI藥物的使用時機(jī)選擇以及療效的動態(tài)評價等方面都具有重要的指導(dǎo)價值。本研究在判讀標(biāo)準(zhǔn)以及療效分析方面所做的嘗試具有一定的借鑒意義。

作者介紹

共同第一作者：湯傳昊，祝令香，張麗娟

共同通訊作者：李曉燕，郭永，劉毅

全文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0009898120303193