摘要

2021新年伊始，光明日?qǐng)?bào)報(bào)道，國(guó)際計(jì)量局近日在其網(wǎng)站上公布了新冠病毒核酸測(cè)量國(guó)際比對(duì)結(jié)果。比對(duì)結(jié)果表明，數(shù)字PCR法可在全世界范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)新冠病毒核酸含量的高精確測(cè)量。該比對(duì)由中國(guó)計(jì)量院提出和聯(lián)合主導(dǎo)，世界多個(gè)國(guó)家計(jì)量機(jī)構(gòu)參與，有利于提高世界各國(guó)新冠病毒核酸測(cè)量結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。數(shù)字PCR，因?yàn)樾鹿诓《緳z測(cè)，走進(jìn)了公眾視野。

研究?jī)?nèi)容

近期，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系郭永團(tuán)隊(duì)在《VIEW》期刊發(fā)表了題為 “Applications of digital PCR in COVID-19 pandemic” 的綜述文章。

在這篇文章中，作者介紹了數(shù)字PCR的原理和優(yōu)點(diǎn)，綜述了數(shù)字PCR在COVID-19大流行中的應(yīng)用，并討論了數(shù)字PCR在COVID-19及相關(guān)臨床應(yīng)用中的挑戰(zhàn)。

基于液滴數(shù)字PCR的SARS-CoV-2檢測(cè)工作流程：

數(shù)字PCR優(yōu)勢(shì)：

1）絕對(duì)定量：通過對(duì)反應(yīng)單元的微分、終點(diǎn)檢測(cè)和泊松分布數(shù)學(xué)模型，在不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的前提下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的絕對(duì)定量；

2）更高的靈敏度：對(duì)反應(yīng)單元進(jìn)行微分的同時(shí)，降低了每個(gè)反應(yīng)單元中非靶標(biāo)分子的占比，從而提高了靶標(biāo)分子的擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏度，對(duì)一些稀有突變的檢出率可以提高到0.001%；

3）更好的穩(wěn)定性：微分反應(yīng)單元的同時(shí)也對(duì)PCR反應(yīng)抑制劑進(jìn)行了稀釋，因此數(shù)字PCR顯示出比熒光定量PCR（qPCR）更好的抑制劑耐受性，可以在復(fù)雜樣品的檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)更好的檢出；

4）更高的精度：在區(qū)分更細(xì)微的拷貝數(shù)差異時(shí)，與qPCR相比，數(shù)字PCR表現(xiàn)出更好的區(qū)分能力，結(jié)果具有更小的變異系數(shù)（CV值）。

數(shù)字PCR，在COVID-19診斷和治療中發(fā)揮重要的作用：

1）對(duì)SARS-CoV-2的高敏檢測(cè)：盡管逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（RT-qPCR）方法是目前COVID-19診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其被報(bào)道存在假陰性率高的問題，而數(shù)字PCR的檢測(cè)限（LoD）比RT-qPCR更低，在一些臨床樣本的檢出中，數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果跟臨床診斷的結(jié)果一致性比RT-qPCR更好，因此對(duì)于低病毒載量樣品的檢測(cè)，數(shù)字PCR可作為RT-qPCR的重要補(bǔ)充。

2）評(píng)估不同類型的臨床樣本的病毒載量：COVID-19測(cè)試可使用多種類型的臨床樣品，包括鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液、糞便和支氣管肺泡灌洗液等，選擇合適的樣本類型對(duì)于準(zhǔn)確的臨床診斷至關(guān)重要。數(shù)字PCR可對(duì)上述樣本中的病毒載量進(jìn)行定量，Yu等人的研究發(fā)現(xiàn)，痰液中病毒載量最高，其次是鼻拭子和咽拭子，提示了使用痰液和鼻咽拭子作為測(cè)試樣本能夠增加陽(yáng)性檢出率。

3）樣本制備方法評(píng)估：安全處理疑似COVID-19病例的樣本對(duì)于保護(hù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室人員免受感染傷害至關(guān)重要。Chen等人使用數(shù)字PCR定量三種滅活方法處理前后樣本中的病毒量，結(jié)果表明滅活處理會(huì)降低可檢測(cè)的病毒RNA的數(shù)量，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；而且相比熱滅活，使用TRIzol試劑滅活對(duì)病毒RNA的影響最小。這項(xiàng)研究表明，數(shù)字PCR可作為評(píng)估核酸樣本預(yù)處理效果的有效方法。

4）動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展：在臨床管理和治療中，密切監(jiān)視病人的病情進(jìn)展非常重要。對(duì)于大多數(shù)病毒感染引起的疾病，病毒載量越高，疾病病情越重。因此，研究病毒載量與COVID-19嚴(yán)重程度之間的關(guān)系非常重要，數(shù)字PCR的高靈敏和高精度使其能夠監(jiān)測(cè)患者病毒載量的變化。Yu等使用了數(shù)字PCR來定量檢測(cè)樣本中的病毒載量，結(jié)果顯示患者在整個(gè)疾病過程中的不同時(shí)間點(diǎn)病毒載量有差異，疾病早期和進(jìn)展期的病毒載量明顯高于恢復(fù)期，說明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病毒載量變化有助于評(píng)估疾病的進(jìn)展。

5）核酸參考品的制備：數(shù)字PCR可以對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量，因此，它已被用于標(biāo)定核酸參考物質(zhì)。例如，van Kasteren等用數(shù)字PCR定量SARS-CoV-2的拷貝數(shù)，用于制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并將RNA進(jìn)行梯度稀釋以評(píng)估不同RT-qPCR試劑盒的分析性能。Fung等用數(shù)字PCR檢測(cè)陽(yáng)性患者樣本中的病毒載量并準(zhǔn)備了系列梯度稀釋液，以確定7種SARS-CoV-2檢測(cè)方法的LoD。因此，數(shù)字PCR可為國(guó)家機(jī)構(gòu)，例如國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局、中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院或者企業(yè)單位制備SARS-CoV-2核酸標(biāo)準(zhǔn)品提供可靠方法。

6）監(jiān)測(cè)環(huán)境中病毒濃度：對(duì)公共環(huán)境中存在的病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)是新冠預(yù)防和控制的重要環(huán)節(jié)，Liu等使用數(shù)字PCR檢測(cè)新冠爆發(fā)期間武漢兩家醫(yī)院不同區(qū)域氣溶膠中的病毒RNA，發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)情況下無法在公共區(qū)域檢測(cè)到SARS-CoV-2 RNA；氣溶膠中病毒RNA的濃度在隔離病房和通風(fēng)病房較低，但是在病人及醫(yī)療工作人員使用的廁所區(qū)域較高，根據(jù)這些結(jié)果，他們認(rèn)為SARS-CoV-2可能通過氣溶膠傳播。Lv等使用RT-qPCR和數(shù)字PCR檢測(cè)殘留在實(shí)驗(yàn)室相關(guān)物體表面的病毒，例如樣品運(yùn)輸和接待相關(guān)設(shè)施、測(cè)試儀器和個(gè)人防護(hù)設(shè)備等。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示所有樣本均為陰性，而61個(gè)樣本中 數(shù)字PCR檢測(cè)出13份樣本為陽(yáng)性；SARS-CoV-2 RNA密度最高的是處理病毒樣本的實(shí)驗(yàn)室人員的手套外側(cè)。這些研究表明，數(shù)字PCR可以監(jiān)測(cè)在不同的環(huán)境中病毒RNA，為疾病預(yù)防和消毒策略提供依據(jù)。

7）SARS-CoV-2突變的檢測(cè)：RNA病毒具有很高的突變率，這與毒力和進(jìn)化能力相關(guān)。病毒突變研究對(duì)于評(píng)估病毒耐藥性、了解與免疫有關(guān)的逃逸機(jī)制和發(fā)病機(jī)理至關(guān)重要。Wong等開發(fā)了基于數(shù)字PCR的檢測(cè)方法來檢測(cè)Vero-E6傳播的分離株、人類類器官、實(shí)驗(yàn)感染的倉(cāng)鼠和COVID-19患者樣本中的PRRA位點(diǎn)或位點(diǎn)上游缺失變異；PRRA缺失的蝙蝠狀冠狀病毒變異體可以在COVID-19患者中自然存在，而且仍然可以傳播，但這些變異在自然感染中的頻率較低，表明它們的競(jìng)爭(zhēng)性不如插入PRRA的野生型。這項(xiàng)研究表明數(shù)字PCR適用于檢測(cè)已知的SARS-CoV-2突變，尤其是針對(duì)一些低頻突變的檢測(cè)。

8）抗SARS-CoV-2病毒藥物的評(píng)估：病毒載量的減少是抗病毒藥的有效性的重要指標(biāo)，例如，在瑞德西韋針對(duì)成人重癥COVID-19患者的一項(xiàng)研究中， Wang等監(jiān)測(cè)了受試者呼吸道標(biāo)本的病毒載量，以確定藥物是否可以加速病毒載量的下降或降低病毒檢出率；此外，Zhu等人監(jiān)測(cè)了患者的病毒載量變化來評(píng)估阿比多爾和洛匹那韋/利托那韋治療COVID-19的治療效果。其中Wang等人通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定病毒載量，Zhu等人僅使用Ct值來表現(xiàn)病毒載量的變化。由于數(shù)字PCR能夠?qū)崿F(xiàn)不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量，而且能夠檢測(cè)到拷貝數(shù)的微小差異，作者認(rèn)為數(shù)字PCR比RT-qPCR更適合用于評(píng)價(jià)抗SARS-CoV-2藥物的有效性，能夠給出更具說服力和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)結(jié)果。

總結(jié)：

作為一種新興的絕對(duì)定量技術(shù)，數(shù)字PCR對(duì)低豐度DNA更加靈敏和特異，能夠絕對(duì)定量，對(duì)擴(kuò)增抑制劑的抗性更強(qiáng)。數(shù)字PCR的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)中得到了完整的體現(xiàn)，在低拷貝病毒樣本檢測(cè)、臨床樣本病毒載量定量、參考品制備、環(huán)境中病毒濃度定量、病毒突變檢測(cè)和藥物評(píng)價(jià)等多方面扮演了重要的角色。

在臨床檢測(cè)中，數(shù)字PCR仍有進(jìn)步空間：

1）通量：數(shù)字PCR系統(tǒng)的樣品檢測(cè)通量需要進(jìn)一步提高，以滿足COVID-19大規(guī)模篩查的需求；

2）自動(dòng)化：需要操作流程更簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度更高的數(shù)字PCR系統(tǒng)來簡(jiǎn)化復(fù)雜的操作過程，減少手動(dòng)操作時(shí)間；

3）成本：需要進(jìn)一步降低儀器及試劑耗材的成本，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力；

4）標(biāo)準(zhǔn)及批文：需要制定國(guó)家或行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，推出商品化的室內(nèi)質(zhì)控品；多中心評(píng)估：基于數(shù)字PCR的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒需要經(jīng)過多中心性能評(píng)估測(cè)試、獲得相關(guān)監(jiān)管部門批準(zhǔn)（FDA/NMPA等），才能為臨床診斷提供合規(guī)依據(jù)。

新羿生物新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸定量檢測(cè)解決方案

面對(duì)新冠疫情，新羿生物充分發(fā)揮科技優(yōu)勢(shì)，其團(tuán)隊(duì)?wèi){借豐富的重大疾病診斷技術(shù)研究經(jīng)驗(yàn)，春節(jié)無休開發(fā)出高靈敏度的新冠核酸檢測(cè)試劑盒，提供了新冠病毒精準(zhǔn)診斷的利器。

新羿TD-1數(shù)字PCR平臺(tái)

新冠病毒 2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒

新羿生物新冠解決方案特點(diǎn)

1. 靈敏度高：最低檢測(cè)下限100 copies/mL；

2. 定量準(zhǔn)確：無需標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

3. 通量較高：一次PCR可以完成96樣本；

4. 操作簡(jiǎn)便：一步上樣，操作簡(jiǎn)單；

5. 封閉檢測(cè)：全封閉體系檢測(cè)，可防止氣溶膠污染，預(yù)防假陽(yáng)性；

6. 特異性好：與其他常見呼吸道病原體（病毒、細(xì)菌、真菌）無交叉反應(yīng)。

論文鏈接：DOI: 10.1002/VIW.20200082

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參考文獻(xiàn)：（略）