酵母細(xì)胞特別是畢赤酵母，是目前生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物的常用宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞殘留的DNA是生產(chǎn)工藝過程中的雜質(zhì)，須對藥物純化工藝后的殘留DNA進(jìn)行監(jiān)測和去除，以確保藥物的純度和安全性。目前，基于熒光定量PCR（qPCR）的方法被廣泛應(yīng)用于宿主細(xì)胞殘留DNA的定量檢測。數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)在這個領(lǐng)域的應(yīng)用也在不斷發(fā)展，它比qPCR具有更高的靈敏度和絕對定量能力。與qPCR相比，用dPCR方法可以從大量藥物中檢測到含量更低的酵母細(xì)胞DNA殘留，顯示了更高的靈敏度，并且該方法擁有較好的檢測精密度和準(zhǔn)確度。

許多蛋白質(zhì)類藥物如胰島素等是在酵母細(xì)胞中制備的，然而宿主細(xì)胞產(chǎn)生的DNA雜質(zhì)對患者用藥構(gòu)成安全隱患，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對蛋白質(zhì)類藥物中DNA雜質(zhì)的限量要求及其嚴(yán)格。大多數(shù)生物類藥物廠商將蛋白質(zhì)藥物中宿主細(xì)胞殘留DNA的標(biāo)準(zhǔn)定在每毫克藥物≤1.0 pg。因此，使用一種非常靈敏的DNA檢測和定量方法十分重要。

將Merck公司生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類藥物人重組IgG-Fc（RP-1）藥物和Sigma公司制備的胰島素配置成50 mg/mL的溶液，這兩種生物藥的宿主細(xì)胞均是酵母細(xì)胞，畢赤酵母總DNA在緩沖液中配制成31 μg/mL。直接將RP-1和胰島素加入到數(shù)字PCR反應(yīng)體系當(dāng)中，每個反應(yīng)體系包含11 μL 2x Supermix、2.2 μL 10x引物和探針、8.8 μL的水做陰性對照或3.3 μL畢赤酵母DNA和5.5 μL的蛋白質(zhì)藥物（或者水）。隨后將體系分割成納米級的微滴，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后檢測熒光信號并對藥物中酵母細(xì)胞殘留DNA進(jìn)行定量分析。

DNA Std (fg)：

酵母細(xì)胞DNA量，6000、600、60、6、0 fg

DNA Std+RP-1：

酵母細(xì)胞DNA加25 μg RP-1

DNA Std+Insulin：

酵母細(xì)胞DNA加50 μg 胰島素

圖1

數(shù)字PCR檢測RP-1和胰島素中畢赤酵母細(xì)胞殘留DNA線性范圍

2. 數(shù)字PCR作為一種精確、靈敏的檢測方法，無需DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以直接定量檢測RP-1和胰島素生物藥中酵母細(xì)胞殘留DNA。

3. 該方法同樣適用于其他生物藥中宿主細(xì)胞DNA殘留檢測。

原文鏈接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0731708516300504