2021年8月12日，廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、分子診斷教育部工程研究中心李慶閣教授團(tuán)隊(duì)與廈門大學(xué)健康醫(yī)療大數(shù)據(jù)國(guó)家研究院、蘇州市立醫(yī)院合作發(fā)表研究型文章于EBioMedicine（IF 8.14）期刊。文章圍繞人類染色體非整倍體檢測(cè)的生物標(biāo)記物——重復(fù)片段（segmental duplication, SD）開發(fā)了計(jì)算程序ChAPDes篩選靶點(diǎn)，使用多色探針熔解曲線技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)及臨床隊(duì)列研究；其中，新羿生物數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)在評(píng)估SD片段和驗(yàn)證無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)方法學(xué)中起到關(guān)鍵作用。

研究背景

胎兒染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷對(duì)于妊娠管理和遺傳咨詢至關(guān)重要，臨床上目前應(yīng)用于染色體非整倍體異常檢測(cè)的技術(shù)主要分為細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)兩大類，如核型分析、熒光原位雜交、染色體微陣列芯片、QF-PCR及MLPA等。近年來，許多研究致力于開發(fā)非侵入性產(chǎn)前檢測(cè)方法，其性能優(yōu)于孕期血清篩查，能夠減輕孕婦侵入性檢查的痛苦，降低流產(chǎn)或感染的風(fēng)險(xiǎn)。

基于二代測(cè)序技術(shù)（NGS）的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）已廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，包括檢測(cè)胎兒13、18、21三體以及性染色體非整倍體異常、亞染色體缺失和重復(fù)等疾病類型。然而，該方法也存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、耗材成本高、操作流程復(fù)雜等缺點(diǎn)。

基于PCR的染色體非整倍體分子檢測(cè)方法，主要通過分析待測(cè)染色體與參考染色體的相對(duì)劑量（relative chromosome dosage, RCD）來鑒別疾病類型。本研究提出一種通用的、潛在的生物標(biāo)記物SD片段可用于染色體非整倍體檢測(cè)，使用一對(duì)共用引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而消除擴(kuò)增偏差并提高定量結(jié)果的可靠性。

圖1：研究工作流程

研究方法

本研究基于新羿生物的微滴式數(shù)字PCR，提出了創(chuàng)新NIPT方案，經(jīng)預(yù)富集后進(jìn)行8個(gè)數(shù)字PCR反應(yīng)的集成檢測(cè)（5萬級(jí)別微液滴每反應(yīng)），并驗(yàn)證了該方法用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)染色體非整倍體異常的可行性。

圖2：新羿生物數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)使用情況

研究結(jié)果

在方法學(xué)建立和體系驗(yàn)證部分，首先，基于實(shí)時(shí)熒光PCR的多色熔解曲線技術(shù)（MMCA）建立兩管PCR反應(yīng)體系，可同時(shí)檢測(cè)多種染色體非整倍體異常，如：47,XX(XY)+13、47,XX(XY)+18、47,XX(XY)+21、45/X、47/XXX、47/XXY、47/XYY等；對(duì)333份羊水細(xì)胞樣本和130份絨毛組織樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證和隊(duì)列研究，總共檢測(cè)到53份常染色體非整倍體異常和37份性染色體非整倍異常，總體特異性為99.64%，靈敏度為100%；其中，檢測(cè)到三份假陽性樣本通過數(shù)字PCR方法驗(yàn)證為陰性樣本，通過對(duì)比不同提取方式的基因組樣本檢測(cè)結(jié)果，數(shù)字PCR方法顯示出更好的耐受性、穩(wěn)定性和精密度。

圖3：數(shù)字PCR方法檢測(cè)染色體非整倍體

根據(jù)泊松分布的數(shù)學(xué)模型，分析數(shù)字PCR方法的精密度的動(dòng)態(tài)范圍與微滴數(shù)、胎兒含量的關(guān)系可知，通過增加陽性微滴數(shù)能夠提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。收集孕周為14~20周的NIPT樣本進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，使用基于數(shù)字PCR方法進(jìn)行21三體綜合征的無創(chuàng)檢測(cè)和雙盲分析，檢測(cè)結(jié)果與NGS完全一致。

圖4：數(shù)字PCR方法用于NIPT的理論模型分析與臨床評(píng)價(jià)

研究意義

本研究證實(shí)SD片段可作為人類染色體非整倍體檢測(cè)的首選生物標(biāo)記物，為大規(guī)模產(chǎn)前診斷提供了新的途徑。結(jié)合數(shù)字PCR技術(shù)，類似的檢測(cè)策略也可用于診斷其他染色體數(shù)目異常和遺傳疾病。

作者介紹

廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生陳昕雯、廈門大學(xué)信息學(xué)院博士生李一凡為該研究的第一作者，蘇州市立醫(yī)院生殖遺傳中心王挺主任、廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院紀(jì)志梁教授、廈門大學(xué)分子診斷教育部工程研究中心李慶閣教授為該研究的共同通訊作者。

原文鏈接：

DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103535